In Vitro αξιολόγηση των μονοκλωνικών αντισωμάτων

Η σήμανση των μονοκλωνικών αντισωμάτων με ραδιοισότοπα είναι σχετικά εύκολη τεχνικά, όμως η σταθερότητα του δεσμού αποτελεί σημαντική παράμετρο για την αποτελεσματική θεραπεία και την αποφυγή ακτινοβολίας των φυσιολογικών ιστών. Η ραδιόλυση του αντισώματος και η καταστροφή των αντισωματικών του ιδιοτήτων μετά την ραδιοσήμανση αποτελεί την δεύτερη σημαντική παράμετρο, η γνώση της οποίας είναι καθοριστική για τον υπολογισμό της δόσης και την αξιολόγηση της αποτελεσματικότητος της θεραπείας. Επί τη βάσει αυτών των δεδομένων κρίνεται σκόπιμο να αναφερθούν τα χαρακτηριστικά των μονοκλωνικών αντισωμάτων που χρησιμοποιήσαμε στην μελέτη αυτή και να μελετηθεί in vitro η συμπεριφορά τους. Παράλληλα, αναζητήθηκαν διάφοροι τρόποι για την βελτίωση της τεχνικής ραδιοσήμανσης και της σταθερότητας του δεσμού αντισώματος-ραδιοϊσοτόπου.

1. Χαρακτηριστικά των Μονοκλωνικών Αντισωμάτων

-81C6: Είναι αντι-γλοίωμα μονοκλωνικό αντίσωμα επίμυος και αναγνωρίζει το αντιγόνο της μεσεγχυματικής εξωκυτταρίου ουσίας του γλοιώματος (GMEM).Εκφράζεται στα ανθρώπινα γλοιώματα, στα κύτταρα των κυτταροκαλλιεργιών κακοήθων γλοιωμάτων και στα ξένα μοσχεύματα ανθρωπίνου γλοιώματος σε αθυμικούς επίμυες. Δεν εκφράζεται στον φυσιολογικό εγκέφαλο και στο εμβρυικό εγκέφαλο (Bourdon και συν.1983).Αυτό το αντιγόνο εκφράζεται επίσης στην πλειοψηφία των κυττάρων του καρκίνου του μαστού και σε ποικιλία άλλων πρωτοπαθών νεοπλασμάτων.

-UJ13A: Είναι ΙgG2a μονοκλωνικό αντίσωμα που προήλθε απο την ανοσοποίηση επίμυος με εμβρυικό ανθρώπινο εγκέφαλο 16 εβδομάδων και είναι ειδικό για τα περισσότερα κύτταρα νευροεκτοδερμικής προελεύσεως. Αναγνωρίζει ιστούς του ΚΝΣ, περιφερικά νεύρα και ιστούς που προέρχονται απο το νευροεκτόδερμα (μυελός των επινεφριδίων, συμπαθητική άλυσος, αραχνοειδή σωμάτια, θυμικό επιθήλιο και οι νευρικές ίνες του γαστρεντερικού πλέγματος).Από νεοπλασματικούς ιστούς αναγνωρίζει γλοιοβλαστώματα, αστροκυττώματα, ολιγοδενδρο-γλοιώματα, γαγγλιογλοιώματα, επενδυμώματα, μηνιγγιώματα, νευρινώματα, μυελοβλαστώματα, νευροβλαστώματα, αμφιβληστροειδο-βλαστώματα, θυμώματα και oat-cell καρκινώματα. Δεν αναγνωρίζει τους όγκους του χοριοειδούς πλέγματος και το κακόηθες μελάνωμα. Αναγνωρίζει επίσης όγκους μη-νευροεκτοδερμικής προέλευσης όπως το ραβδομυοσάρκωμα, ο όγκος Wilms κλπ. Το UJ13A δεν αντιδρά με λεμφώματα, με καρκινώματα και με αυτό τον τρόπο συμβάλλει στην ιστολογική διάκριση των πρωτοπαθών όγκων του εγκεφάλου απο τα λεμφώματα και τα μεταστατικά καρκινώματα. Πρόσφατες μελέτες φανερώνουν ότι το UJ13A αναγνωρίζει μία γλυκοπρωτείνη, η οποία διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στην διαμεσοκυττάριο αντίδραση και προσκόλληση των κυττάρων μεταξύ τους. Η γλυκοπρωτείνη ονομάζεται Μόριο για την Πρόσφυση των νευρικών κυττάρων (NCAM) (Patel Κ. και συν.1989).Το NCAM έχει 4 ισομορφές 180Kd,170Kd,140Kd και 120Kd στον φυσιολογικό εγκέφαλο. Οι όγκοι εγκεφάλου παρουσιάζουν διαταραχές στην κατανομή των ισομορφών αυτών. Τέλος, το NCAM φαίνεται να ρυθμίζεται απο συγκεκριμένο γονίδιο το οποίο δεν έχει ακόμη προσδιορισθεί.

-45.6: Πρόκειται για IgG2b μονοκλωνικό αντίσωμα το οποίο προήλθε απο την ανοσοποίηση επίμυος με την κυτταρική σειρά μυελώματος TG 1,7 και δεν έχει βρεθεί μέχρι σήμερα με ιστοχημικές μελέτες να αναγνωρίζει αντιγόνο ανθρωπίνου ιστού (Marguilieς και συν.1976). -ERIC-1: Πρόκειται για IgG1 μονοκλωνικό αντίσωμα που προήλθε απο την ανοσοποίηση του επίμυος με πρόσφατη κυτταρική σειρά αμφιβληστροειδοβλαστώματος Υ79 και αναγνωρίζει την γλυκοπρωτείνη NCAM, όπως και το αντίσωμα UJ13A.Αναγνωρίζει το NCAM σε ποικιλία εμβρυϊκών ιστών, όπως στον εμβρυϊκό εγκέφαλο, στους νεφρούς, τον μυικό ιστό, την καρδία και τους πνεύμονες. Στους ιστούς του ενήλικα η έκφραση του αντιγόνου είναι περιορισμένη. Εκφράζεται στον εγκέφαλο, τα περιφερικά νεύρα (κινητική και αυτόνομη μοίρα) και στον μυελό των επινεφριδίων. Αναγνωρίζει ποικιλία όγκων όπως το UJ13A.Τα αντισώματα ERIC-1 και UJ13A αν και αναγνωρίζουν το ίδιο αντιγόνο δεν έχει βρεθεί μεταξύ τους διασταυρούμενη αναστολή όταν χορηγούνται συγχρόνως. Φαίνεται να αναγνωρίζουν διαφορετικό επίτοπο επί του ιδίου αντιγόνου και ως εκ τούτου μπορούν να χορηγηθούν συγχρόνως. Ενα άλλο αντίσωμα που αναγνωρίζει το ίδιο αντιγόνο με τα δύο προηγούμενα αντισώματα είναι το 5.1Η11.Διασταυρούμενη αναστολή σε σύγχρονη χορήγησης των τριών αντισωμάτων δεν διαπιστώθηκε.

-Μ340: Προήλθε απο την ανοσοποίηση του επίμυος με κύτταρα ανθρωπίνου μυελοβλαστώματος και αναγνωρίζει ένα ογκοεμβρυικό αντιγόνο που εκφράζεται στον εμβρυικό ανθρώπινο εγκέφαλο και σε όγκους του νευροεξωδέρματος. Το αντιγόνο αυτό δεν βρίσκεται στον εγκέφαλο του ενήλικος. Το αντίσωμα Μ340 έχει πολλές ιστοχημικές ομοιότητες με το αντίσωμα UJ181.4, αλλά αναγνωρίζει διαφορετικό επίτοπο.

2. Πειραματική αξιολόγηση των μονοκλωνικών αντισωμάτων

ΥΛΙΚΑ-ΜΕΘΟΔΟΙ:

α. Επιλογή Αντισωμάτων: Χρησιμοποιήθηκαν τα αντισώματα -M340 UJ13A -ERIC-1

β. Ραδιοϊσότοπα: Χρησιμοποιήθηκε το Ιώδιο-131 και η ραδιοσήμανση έγινε με την μέθοδο του ιωδογονίου. Η ειδική δραστηριότητα της ραδιοσήμανσης κυμαίνεται απο 1μCi/μg έως 20μCi/μg. Χρησιμοποιήθηκαν 3 διαφορετικά δείγματα αντισωμάτων και η ραδιοσήμανση έγινε με διαφορετική ποσότητα ιωδίου διπλάσια της προηγουμένης (πίναξ 5). Σε όλα τα δείγματα των αντισωμάτων έγινε αξιολόγηση με:

1. Καθίζηση με τριχλωροακετοοξικό οξύ

2. Ανάλυση του ενεργά ανοσολογικού κλάσματος με υγρά χρωματογραφία (FPLC) και

3. Μέτρηση της αντισωματικής ιδιότητος των αντισωμάτων σε διαφορετικό χρονικό διάστημα 0-4-8 ημερών (Ραδιοανοσοσύνδεση) (Binding Assay).

ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ:

α. Καθίζηση με τριχλωροοξικό οξύ (TCA): Σε όλα τα δείγματα των αντισωμάτων ERIC-1 και M340 που μελετήθηκαν, το ποσοστό της σημάνσεως την πρώτη ημέρα της ραδιοσήμανσης ήταν 100% και μειώνεται προοδευτικά μετά 8 ημέρες στο 90% (πίναξ 6). Ιδιαιτερότητα παρουσίασε το αντίσωμα UJ13A,όπου διαπιστώθηκε σημαντικά χαμηλό ποσοστό ραδιοσήμανσης. Αυτό αποδόθηκε στο όξινο pH του διαλύματος της ραδιοσήμανσης. Εγινε επανάληψη της ραδιοσήμανσης με την χρήση διαλύματος 1Μ Trisma pH7,5. Το τελικό αποτέλεσμα με την μέθοδο καθίζησης με τριχλωρο ακετοοξικό οξύ ήταν η αύξηση του ποσοστού της ραδιοσήμανσης στο 92,59% και με ομαλή πτώση μετά απο 8 ημέρες στο 84,37% (σχ.2).

Υγρά Χρωματογραφία (FPLC): Ολα τα δείγματα των ραδιοσεσημασμένων αντισωμάτων διήλθαν διαμέσου της στήλης σεφαρόζης και έγινε συλλογή του εκπλύματος της στήλης σε φυαλίδια 1ml. Ακολούθησε μέτρηση της ραδιενέργειας των φιαλιδίων (90 φιαλίδια για έκαστο δείγμα αντισώματος) σε γ-counter. Tο αποτέλεσμα παρίσταται σε γραφική παράσταση (σχ.3). Η χρωματογραφική στήλη έχει την ικανότητα να διαχωρίζει τις διάφορες ουσίες με βάση το μοριακό τους βάρος. Ως εκ τούτου τα ανοσοσυμπλέγματα διέρχονται ταχέως δια της στήλης διότι έχουν μεγάλο μοριακό βάρος, το σεσημασμένο αντίσωμα με μικρότερο μοριακό βάρος ακολουθεί και τέλος εξέρχεται της στήλης το ελεύθερο ιώδιο λόγω του μικροτέρου μοριακού βάρους. Σε όλα τα δείγματα παρατηρήσαμε προοδευτική αύξηση του ελευθέρου ιωδίου και των συσωματωμένων ανοσοσυμπλεγμάτων με την πάροδο των ημερών (σχ.4) .Ιδιαιτερότητα αποτέλεσε το αντίσωμα Μ340, το οποίο παρουσίασε υψηλό ποσοστό συσωματω-μένων ανοσοσυμπλόκων (σχ.5). γ. Ανοσολογικά ενεργό κλάσμα (Binding Assay): Χρησιμοποιήθηκε υπερπάρκεια αντιγόνου (βλέπε περιγραφή μεθόδου) και για αρνητικό μάρτυρα χρησιμοποιήσαμε αντίσωμα κονίκλου σεσημασμένο με ιώδιο-125 (πίναξ 7).

Ως φαίνεται απο τον πίνακα 7 το αντίσωμα Μ340 παρουσιάζει χαμηλό ποσοστό ανοσολογικά ενεργού κλάσματος σε όλα τα δείγματα. Η επανάληψη όλων των μεθόδων δεν παρουσίασε σημαντική διαφορά από τα ανωτέρω ευρήματα. Συγκρινόμενα αυτά τα ευρήματα με το αποτέλεσμα της υγράς χρωματογραφίας του ιδίου αντισώματος διαπιστούται, οτι δεν υπάρχει η αναμενόμενη προοδευτική μείωση της αντισωματικής ικανότητος του αντισώματος σε σύγκριση με την αύξηση των συσσωματωμένων ανοσοσυμπλόκων. Αυτό πιθανόν να οφείλεται στην διατήρηση απο τα ανοσοσυμπλέγματα της αντισωματικής τους ικανότητας παρά την αλλοίωση την οποία υφίστανται με την συσσωμάτωση. Διαπιστώθηκε επίσης μεγάλη απώλεια της αντισωματικής ικανότητος του αντισώματος ERIC-1 στο δείγμα-3 την ογδόη ημέρα. Πιθανόν να οφείλεται στην ευαισθησία του αντισώματος στην επίδραση της ραδιενέργειας (σχ.6).

ΣΥΖΗΤΗΣΗ: Τα μονοκλωνικά αντισώματα που μελετήθηκαν in vitro αποτελούν τα συχνότερο χρησιμοποιούμενα αντισώματα στο εργαστήριο μας για την θεραπεία των κακοήθων όγκων του εγκεφάλου. Η μελέτη αυτή κρίθηκε σκόπιμη εξ αιτίας της ποικίλης φαρμακοκινητικής συμπεριφοράς που παρουσίαζαν αυτά τα αντισώματα in vivo. Δεν αναφέρεται μέχρι σήμερα στην βιβλιογραφία παρόμοια μελέτη πειραματικής αξιολόγησης της ραδιοσήμανσης των αντισωμάτων, καίτοι πολλοί συγγραφείς αναφέρουν οτι η ραδιόλυση του αντισώματος απο το ραδιοισότοπο αυξάνει με την αύξηση της ποσότητος της ραδιενέργειας. Διαπιστώθηκε οτι και τα τρία μονοκλωνικά αντισώματα παρουσίασαν προοδευτική αύξηση της ποσότητος του ελευθέρου ραδιενεργού ιωδίου την 8 ημέρα μετά την ραδιοσήμανση. Μεγαλύτερη ποσότητα ελευθέρου ραδιενεργού ιωδίου βρέθηκε στο δείγμα-3 των αντισωμάτων, το οποίο είχε την μεγαλύτερη ποσότητα ραδιενέργειας. Το αντίσωμα UJ13A παρουσίασε χαμηλό ποσοστό ραδιοσήμανσης και μεγάλη ποσότητα ελευθέρου ραδιενεργού ιωδίου στα δείγματα-1 και 2, ενώ στο δείγμα-3 το ποσοστό ραδιοσήμανσης ήταν ικανοποιητικό 76,79%. Για την ιδιαιτερότητα αυτή του αντισώματος UJ13A ενοχοποιήθηκε το όξινο pH του διαλύματος ραδιοσήμανσης. Η επανάληψη του πειράματος με ουδέτερο διάλυμα (pH 7,5) αύξησε το ποσοστό και την σταθερότητα του ραδιοανοσοσυμπλέγματος. Παρόμοια συμπεριφορά δεν διαπιστώσαμε στα αντισώματα ERIC-1 και M340. Τα ανωτέρω αποτελέσματα επιβεβαιώθηκαν και με την μέθοδο της υγράς χρωματογραφίας (FPLC). Σε όλα τα δείματα των αντισωμάτων διαπιστώσαμε αύξηση του ελευθέρου ραδιενεργού ιωδίου και αύξηση των συσωματωμένων ανοσοσυμπλεγμάτων την 8 ημέρα (σχ.4). Στο σχήμα 5 απεικονίζεται η ανοσολογική εικόνα του αντισώματος Μ340 προ και μετά την αλλαγή του pH. Διαπιστώθηκε μεγάλη αύξηση των ανοσοσυμπλεγμάτων σε όξινο pH, τα οποία απεκαταστάθησαν στο φυσιολογικό μετά την αλκαλοποίηση του pH. Η αντισωματική ικανότητα (Α.Ι) των αντισωμάτων μετά την ραδιοσήμανση ήταν ικανοποιητική για τα αντισώματα ERIC-1 και UJ13A.Παρουσίασαν όμως προοδευτική μείωση της Α.Ι με την πάροδο των ημερών, με την μεγαλύτερη μείωση στο δείγμα-3 (πίνακας 7).Η Α.Ι του αντισώματος ERIC-1 την 8η ημέρα ήταν πολύ χαμηλή σε σύγκριση με τα αντίσωμα UJ13A και M340.

Συγκρίνοντας τα τρία δείγματα του αντισώματος μεταξύ τους διαπιστούται μεγάλη μείωση της Α.Ι του αντισώματος και σε χαμηλές ποσότητες ραδιενέργειας. Πιθανό να οφείλεται σε αυξημένη ακτινοευαισθησία του μορίου του αντισώματος ERIC-1. Το αντίσωμα Μ340 παρουσίασε χαμηλό ποσοστό Α.Ι χωρίς την αναμενόμενη μείωση της με την πάροδο των ημερών, παρά την δημιουργία ανοσοσυμπλεγμάτων και την αύξηση του ελευθέρου ραδιενεργού ιωδίου. Η αδυναμία του αντισώματος να αναγνωρίσει το αντιγόνο πιθανόν να οφείλεται και στην χαμηλή έκφραση του αντιγόνου στην επιφάνεια των κυττάρων.

ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ:

1. Οι χημικές ιδιότητες, ο τρόπος λήψης του αντισώματος απο το ασκητικό υγρό ή απο την καλλιέργεια υβριδίων, και το pH του διαλύματος ραδιοσήμανσης, αποτελούν σημαντικούς παράγοντες για την in vitro και κατ' επέκταση την in vivo συμπεριφορά του ραδιοανοσοσυμπλέγματος.

2. Η ραδιόλυση του αντισώματος και η μείωση της αντισωματικής του ικανότητος σε υψηλά ποσοστά ραδιενέργειας, μας οδήγησε στην τροποποίηση της μεθόδου ραδιοσήμανσης με χαμηλές ποσότητες ραδιοϊσοτόπου, καίτοι αυτό αυξάνει τον κίνδυνο έκθεσης του προσωπικού στην ραδιενέργεια. και

3. Θεωρούμε αποτελεσματική την ραδιοσήμανση του αντισώματος όταν η αντισωματική ικανότητα αυτού είναι μεγαλύτερη απο 50%.

copyright © 2001-2002

Επικοινωνία

Τηλ:      +302106857614

            

Email:   Αυτή η διεύθυνση ηλεκτρονικού ταχυδρομείου προστατεύεται από τους αυτοματισμούς αποστολέων ανεπιθύμητων μηνυμάτων. Χρειάζεται να ενεργοποιήσετε τη JavaScript για να μπορέσετε να τη δείτε.